Eine Spezialeinheit des amerikanischen Militärs hat die Aufgabe, eine neu entwickelte High-Tech-Waffe des Mars-Konzerns aus der Fabrik in Kirgistan sicher in die heimischen Gefilde zu

bringen. Mit dabei auch Captain „Duke“ Hauser (Channing Tatum) und sein Partner Wallace „Ripcord“ Weems (Marlon Wayans). Doch kurz nach Verlassen der Fabrik werden sie von einer geheimen terroristischen Organisation COBRA unter der Führung von Baroness (Sienna Miller) angegriffen. Diese war früher mit Duke liiert, aus diesem Grunde verschont sie die beiden Soldaten auch. Doch als sie gerade mit der neuartigen Waffe abhauen will, greift G.I. Joe ein. Die Einheit weltweiter Top-Elite-Agenten und –Soldaten unter der Leitung von General Clayton „Hawk“ Abernathy (Dennis Quaid) schafft es, die Baroness von ihrem Vorhaben abzuhalten.

Die G.I. Joe schnappen sich den Koffer mit den Sprengköpfen der High-Tech-Waffe und die beiden übrig gebliebenen Soldaten des Militärs und verschanzt sie in ihrer geheimen Basis unter einer großen Wüste in Afrika. Kurz nachdem das passiert ist, planen die Terroristen auch schon den nächsten Überfall auf die Basis, bei dem es ihnen später auch gelingt, das Ziel der Begierde in ihren Besitz zu bringen. In der Zwischenzeit absolvieren Duke und Ripcord ein Probetraining der G.I. Joe. Sie werden zunächst für gut befunden und dürfen der Einheit vorübergehend beitreten. Normalerweise ist es so, dass sich die Einheit ihre Soldaten selber sucht…

Die Mitglieder der terroristischen Organisation Cobra machen sich derweil daran, Macht und Auswirkungen der neuen Waffe zu demonstrieren. Sie wollen das Wahrzeichen Paris – den Eiffelturm – dem Erdboden gleich machen. Da haben die Soldaten der G.I.Joe natürlich was dagegen. Außerdem plant Cobra den Abschuss von Raketen mit den entwendeten Sprengköpfen auf Washington, Moskau und Peking. Nun beginnt für die G.I. Joe ein Wettlauf mit der Zeit. Sie müssen die Machtzentrale der Terroristen finden, um die Raketen vor dem Einschlag in die Metropolen abzuhalten und die Menschheit vor einer terroristischen Herrschaft zu bewahren…